Клеточная мембрана — структура, состоящая из белков и липидов, которая отделяет содержимое клетки живого организма от внешней среды и позволяет сохранить ее целостность. В биологии и медицине особое внимание уделяют изучению изменений мембранного потенциала, то есть разницы в электрическом потенциале между внутренней и внешней сторонами клеточной мембраны. Эта разница возникает из‑за неравномерного распределения ионов внутри и снаружи клетки.
Как объясняют ученые, изменение мембранного потенциала играет ключевую роль в передаче нервных импульсов, мышечном сокращении и других физиологических процессах, необходимых для функционирования организма. Эта характеристика изменяется при возникновении патологий: например, у раковых клеток этот показатель значительно ниже, чем у здоровых. Один из способов изучения изменений мембранного потенциала клеток — использование специальных флуоресцентных белков. С помощью методов генной инженерии такие белки вводят в клетку, и они начинают светиться под воздействием света, причем интенсивность свечения определяется величиной мембранного потенциала. Такой подход позволяет наблюдать происходящие в клетке процессы в режиме реального времени, однако из‑за слабого сигнала возможности применения флуоресцентных белков‑сенсоров ограничены.
Сотрудники Санкт‑Петербургского государственного университета совместно с коллегами из других научно‑образовательных организаций нашли способ значительного усиления свечения белков. Они объединили несколько подходов и использовали методы направленной эволюции и компьютерного дизайна.
Химики исследовали фоточувствительный мембранный белок археородопсин‑3, однако используемый подход может применяться и при разработке других белков.
«В предыдущих исследованиях более яркие варианты сенсоров мембранного потенциала на основе археородопсина‑3 находили, используя метод направленной эволюции, то есть имитируя процесс эволюции „в пробирке“. Мы использовали набор относительно ярких мутантных форм этого белка, полученный ранее, и построили их „цифровые двойники“ с помощью методов квантовой химии и биоинформатики», — рассказал руководитель гранта, доцент кафедры медицинской химии СПбГУ доктор химических наук Михаил Рязанцев.
Он добавил, что это позволило определить отличия между разными формами белков и предложить новые, более яркие варианты сенсоров для изучения мембранного потенциала.
В процессе направленной эволюции последовательно генерируются «поколения» мутантных форм белков со стохастическим (то есть случайным) распределением аминокислотных замен. На каждом этапе отбираются наиболее «приспособленные» белки, в данном случае белки с наибольшей яркостью свечения. Именно они используются для создания нового поколения. Такой подход позволяет ученым получить «улучшенные» белки даже при отсутствии данных об их структуре и механизмах, которые контролируют те или иные свойства. Однако при таком подходе не всегда удается получить самый оптимальный набор аминокислотных замен — как и в процессе эволюции не всегда формируется оптимальный набор характеристик организма.
В работе авторы использовали инфраструктуру уникального центра коллективного пользования — Научного парка СПбГУ: ресурсные центры «Развитие молекулярных и клеточных технологий», «Оптические и лазерные методы исследования вещества», а также оборудование МГУ имени М. В. Ломоносова и Санкт‑Петербургского политехнического университета Петра Великого.
Опираясь на результаты компьютерного моделирования, химики СПбГУ определили, какие модификации — аминокислотные замены в белке — позволят усилить яркость свечения. Оказалось, что основное отличие ярких вариантов сенсоров от тусклых заключается в состоянии протонирования двух аминокислотных остатков. Один из них протонирован в ярком состоянии, а другой в тусклом, а переключение происходит за счет переноса протона по «проводу» из молекул воды, которые ученые СПбГУ нашли с помощью методов компьютерного моделирования.
«Полученные нами белки‑сенсоры — мутантные формы археоропсина‑3 — имеют ряд преимуществ по сравнению с уже известными вариантами. Они обладают значительно более яркой флуоресценцией, для их активации можно использовать „красный“ лазер, поскольку нам удалось сдвинуть спектр их поглощения в длинноволновую область. Такое излучение лучше проникает в биологические ткани, что более перспективно для последующего применения этих белков в медицине», — объяснил научный сотрудник кафедры медицинской химии СПбГУ Дмитрий Николаев.
Усовершенствованные варианты сенсоров могут пригодиться в биомедицинских исследованиях — в частности, при изучении работы мозга и сердца с помощью флуоресцентного микроскопа. Белки с увеличенным свечением позволяют с помощью специального микроскопа отслеживать даже самые быстрые изменения потенциала отдельных нейронов. Кроме того, разработанные белки‑сенсоры могут быть полезны при разработке лекарств для лечения заболеваний мозга, таких как болезнь Паркинсона и эпилепсия, при создании препаратов для терапии сердечно‑сосудистых заболеваний, а также для диагностики различных патологий.
Результаты исследования, поддержанного грантом РНФ и посвященного празднованию 300‑летия СПбГУ, опубликованы в научном журнале ACS Physical Chemistry Au, а статья размещена на обложке печатной версии издания.
