ПЦР — точный метод диагностики инфекций и наследственных признаков по ДНК/РНК. Но классический анализ может занимать от нескольких часов до суток. Для его ускорения разрабатывают портативные системы, такие как конвективная ПЦР, где микрокамера-чип копирует материал всего за 30–40 минут. Однако такому массовому внедрению мешает неточность их проектирования. Существующие модели считают раствор ДНК/РНК однородным, но реальные молекулы — длинные нити, которые смещаются к стенкам и движутся из-за разности температур. Все это вызывает ошибки: медленную работу или ложноотрицательные результаты.
Пермские ученые первыми в мире создали компьютерную модель, точно предсказывающую поведение частиц в микрокамере. Это позволит проектировать более эффективные, быстрые и надежные ПЦР-системы.
За последние годы аббревиатура «ПЦР» — полимеразная цепная реакция — прочно вошла в нашу жизнь, став основой для тестов на COVID-19, выявления генетических заболеваний и установления отцовства. Этот метод — «золотой стандарт» диагностики, позволяющий по крошечному фрагменту ДНК или РНК точно идентифицировать возбудителя болезни или уникальную генетическую метку человека. От скорости и точности этого анализа зависит не только здоровье пациента, но и коллективный иммунитет целых регионов.
Чтобы ПЦР сработала, пробирку с образцом биоматериала помещают в аппарат, который быстро меняет температуру. Например, для теста на отцовство берут соскоб клеток с внутренней стороны щеки ватной палочкой. В этих клетках есть ДНК, но ее всего несколько молекул — не разглядеть. Аппарат циклами нагрева и охлаждения заставляет эти молекулы копироваться. После 30-40 таких повторов из одной молекулы получаются миллиарды ее точных клонов. Детектор сравнивает эти размноженные фрагменты ДНК отца и ребенка — если участки совпадают, отцовство подтверждено.
Однако классический лабораторный анализ требует времени — от нескольких часов до нескольких суток. Поэтому в мире растет спрос на портативные, быстрые и доступные системы для «полевой» диагностики — в кабинете врача или в отдаленных районах.
Одним из перспективных решений, которое пока не стало массовым, является конвективная ПЦР. Вместо громоздкого лабораторного аппарата здесь используется плоская микрокамера-чип (с размером со смартфон или меньше), где нижняя часть нагрета, а верхняя охлаждена. Это создает естественное движение жидкости: она начинает медленно циркулировать сама по себе, проходя через зоны с нужной для реакции температурой.
Например, врач, чтобы проверить пациента на грипп, может взять мазок из носа, смешать с реактивами и поместить раствор в такое устройство. Если в образце есть хотя бы несколько молекул РНК вируса, они начнут «путешествовать» по температурным зонам, многократно копируясь. Уже через 30–40 минут прибор обнаружит накопленные миллиарды одинаковых фрагментов и выдаст результат.
Но чтобы такие аппараты стали по-настоящему массовыми и безотказными, их нужно уметь правильно проектировать. А это упирается в фундаментальную проблему: сегодня инженеры не могут точно рассчитать, как ведут себя молекулы внутри крошечной, неравномерно нагретой камеры.
Существующие компьютерные модели для их проектирования слишком просты и неточны. Как правило, они рассматривают раствор ДНК как однородную жидкость — будто бы молекулы, попадая в раствор, равномерно распределяются по среде и двигаются по замкнутой траектории: от холодной температуры снизу до теплой сверху, там делятся, затем многократно повторяют эти циклы.
Ученые ПНИПУ провели исследование и выяснили, что в реальности молекулы ДНК/РНК ведут себя иначе. Каждая молекула ДНК включает в себя десятки тысяч нуклеотидов — это длинная последовательность, которая ведет себя в среде как протяженная нить. Таким образом, законы диффузии молекул ДНК в среде существенно отличаются от диффузии точечных включений. Вместо того, чтобы равномерно перемещаться с потоком, они могут двигаться и в сторону. Например, молекулы ДНК способны смещаться к стенкам, скапливаться в углах и, что самое важное, «чувствовать» разницу температур, мигрируя от горячих зон к холодным. Этот эффект называется термофорезом.
Игнорирование такого поведения создает расхождение между расчетными моделями и реальностью. На практике спроектированный по старым алгоритмам прибор может работать медленнее ожидаемого, а иногда и выдавать ложноотрицательный результат, не обнаруживая вирус при его наличии. Поэтому для создания нового поколения быстрых и безошибочных устройств нужна гораздо более точная «карта» поведения молекул внутри микрокамеры.
Для решения этой проблемы ученые Пермского Политеха впервые в мире создали компьютерную модель конвективной ПЦР, которая точно предсказывает поведение частиц внутри микрокамеры, что позволяет улучшить конструкцию чипов и создавать более эффективные диагностические устройства.
«В отличие от всех предыдущих моделей, ключевым новшеством стало то, что мы впервые стали рассматривать молекулы ДНК как самостоятельные микрочастицы, способные двигаться независимо от потока жидкости.Именно этот подход позволил нам учесть главный ранее упускаемый эффект — движение частиц от тепла к холоду, или термофорез», — рассказал Рамиль Сираев, доцент кафедры «Прикладная физика», кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник.
Так удалось выяснить, что именно самостоятельное движение молекул к холоду нарушает температурный режим внутри чипа и становится причиной ошибок в результатах теста.
«В этом и была главная проблема. ПЦР похожа на лавину: молекул становится все больше и больше, так как они копируют сами себя в каждом цикле реакции. Сначала их движение почти незаметно, но когда их тысячи, они начинают смещаться к холодным стенкам. Наши расчеты показывают, что уже через 10 минут это может замедлить поток жидкости в чипе вдвое. Течение становится неустойчивым, и это как раз вызывает тот самый опасный перепад температур, который срывает реакцию. Именно поэтому один и тот же прибор может выдать как точный результат, так и ошибочный», — объяснил Дмитрий Брацун, заведующий кафедрой прикладной физики ПНИПУ, доктор физико-математических наук.
Чтобы это наглядно доказать, ученые провели численный эксперимент. Они взяли за основу реальный микрочип, который в лабораторных условиях периодически давал сбойные результаты, и создали его точную цифровую копию.
Сначала они запустили расчет по старой схеме, где молекулы ДНК считались равномерно распределенной частью жидкости. Результат был неточным: программа показывала равномерный нагрев и стабильную циркуляцию, что никак не объясняло реальные ошибки.
Затем исследователи включили в модель ключевое новшество — самостоятельное движение молекул к холодным стенкам. Результат оказался совершенно другим. На экране компьютера четко проступили проблемные зоны: в одних участках молекулы образовывали плотные скопления, забивающие проход, а в других из-за того, что жидкость переставала нормально циркулировать, возникали локальные перегревы или недогревы. Именно эти искажения температурного поля и были той самой скрытой причиной, по которой часть ДНК не копировалась, а прибор выдавал ошибочный результат. Таким образом, новая система расчетов не только предсказала проблему, но и визуализировала ее источник, чего прежде сделать не удавалось.
Теперь, имея такую наглядную «карту» проблем, инженеры могут целенаправленно устранять их: например, изменить форму каналов или перераспределить нагрев. Это позволяет заранее спроектировать микрочип, в котором движение молекул к холоду не будет создавать помех, а реакция будет идти с максимальной скоростью и точностью.
Следовательно, разработка ученых открывает путь к созданию нового поколения диагностических устройств: компактных, быстрых и, что самое важное, надежных. Благодаря точному расчету всех параметров, время анализа в таких системах может сократиться с нескольких часов до 15-20 минут. Такие приборы смогут одинаково точно работать и в современной лаборатории, и в полевом госпитале, обеспечивая быструю и точную диагностику там, где это необходимо.
Статья опубликована в «Российском журнале биомеханики». Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда, проект «Гидромеханика перфузионных биореакторов с функционально-градиентными свойствами».
