Полигидроксиалканоаты (ПГА) — биоразлагаемые полимеры, которые синтезируют бактерии. Они биосовместимы с живыми клетками и тканями и разлагаются в организме на нетоксичные вещества, поэтому считаются идеальными кандидатами для биомедицинских применений. Например, для создания имплантатов, шовных материалов и скаффолдов для тканевой инженерии. Но мало просто получить биосовместимый материал и медицинское изделие. Нужно, чтобы клетки на нем прикреплялись и росли. Это зависит от рельефа поверхности на микро- и наноуровне. Поэтому текстура поверхности изделия имеет важное значение для использования материала в биомедицинских приложениях.
Ученые ИТМО (Санкт-Петербург), Красноярского научного центра СО РАН и Сибирского федерального университета совместно с коллегами из Нидерландов и США определили, какая толщина и рельеф полимерных ПГА пленок лучше подходят для прикрепления и роста клеток. Пленки были получены из специального биоразлагаемого полимера семейства ПГА.
Тип полимера выбрали за удобство в переработке, высокую биосовместимость и экономичность для крупномасштабного биосинтеза. Пленки получали из четырех растворов полимера разной концентрации. Чем концентрированнее был раствор, тем толще и грубее получалась пленка. На эти пленки ученые «посадили» клетки миобластов линии C2C12. Эти клетки — предшественники мышечной ткани и один из самых удобных и распространенных объектов для тестирования биоматериалов.
Перед учеными встал вопрос, как оценить пригодность поверхности для клеток. Обычно исследователи делают такую работу вручную: считают клетки, делают замеры, отдельно описывают рельеф. Это долго, субъективно и плохо переносится на повторные эксперименты. Поэтому авторы разработали воспроизводимый алгоритм, который делает все то же самое, но автоматически: сегментирует изображения клеток и выдает метрики рельефа и самих клеток.
К тому же алгоритм связывает все этапы в одну цепочку: от технологии изготовления пленки и характеристики ее поверхности, до данных, как на ней ведут себя клетки. По словам исследователей, такой подход позволяет не перебирать наугад, а целенаправленно подбирать параметры. Он может быть применим ко всем типам клеток человеческого организма при разработке новых полимерных имплантатов.
«Для этого исследования наша научная группа из Научно-образовательного центра инфохимии ИТМО разработала подход, который позволяет автоматически оценивать, как клетки взаимодействуют с поверхностью полимерных пленок. Изображения клеток на снимках, полученных с флуоресцентного микроскопа, сегментируются с помощью сверточной нейронной сети (CNN), после чего качество сегментации проверяется. Из полученных данных затем выделяются основные характеристики клеток — их форма, размер и другие морфометрические признаки, которые мы сопоставляем с характеристиками поверхности, полученными из изображений, сделанных с помощью атомно-силовой и сканирующей электронной микроскопии (АСМ и СЭМ). Так мы выявляем характеристики поверхности, сильнее всего связанные с биосовместимостью образцов», — отметил Павел Зун, доцент НОЦ инфохимии, руководитель научной группы биомедицинских вычислений Университета ИТМО.
Алгоритм помог фиксировать, как клетки вели себя на пленках: как они прикрепляются и разрастаются, и насколько эффективно пленка поддерживает рост ткани. Оказалось, что на более толстых и шероховатых пленках клетки прикрепляются лучше. Ключевую роль в этом процессе играют различные неровности на поверхности пленки, за которые клетки могут зацепиться. Тонкие пленки, полученные из слабых растворов, имеют преимущественно гладкий рельеф, за который клетки цепляются хуже. Более толстые пленки, наоборот, богаты неровностями и углублениями, что обеспечивает лучшее зацепление, более высокие рост и активность клеток.
«При формировании пленок из более концентрированных и более вязких полимерных растворов растворитель медленнее испаряется. Связано это с тем, что высокая вязкость замедляет движение молекул растворителя из глубины раствора к его поверхности. Полимер при этом кристаллизуется медленнее. Замедленная кристаллизация полимера по мере испарения растворителя сопровождается образованием более крупных и жестких кристаллических структур, которые и создают более развитую и шероховатую поверхность пленок. Клетки «сажают» на пленки, как растения на грядку. От того, насколько эта «грядка» рыхлая, зависит, как крепко клетка будет на ней «сидеть» и множиться. Полученные в этой комплексной работе результаты имеют важное значение для проектирования поверхностей изделий биомедицинского назначения на основе ПГА и других полимеров. Применять это можно в тканевой инженерии для создания подложек (скаффолдов), на которых клетки должны активно расти и формировать новую ткань, например, для восстановления мышц, костей, хряща, сосудов и в регенеративной медицине — для имплантатов, которые должны быстро обрастать собственными клетками пациента, формировать новые ткани в месте повреждения и при этом не отторгаться», — прокомментировала результаты исследования Татьяна Волова, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией Института биофизики СО РАН и кафедрой биотехнологии СФУ.
Результаты исследования опубликованы в журнале Langmuir.
